TEKNIK PEMBUATAN SEDIAAN OLESAN DARAH

Metode oles (smear method) adalah suatu cara membuat sediaan dengan jalan mengoles atau membuat selaput tipis dari bahan yang berupa cairan atau bukan cairan di atas gelas obyek. Metode ini dapat dipakai untuk pembuatan sediaan darah, nanah sumsum tulang merah, mukosa mulut, dan mukosa vagina.

Tujuan

Mengenal tahap-tahap pembuatan, bahan dan alat untuk praktikum teknik pembuatan sediaan dengan metode oles/smear.

Bahan

1. Darah manusia
2. Etanol 70 %
3. Metanol
4. Larutan Gemsa 3 % dalam methanol
5. Akuades dingin yang sebelumnya sudah direbus
6. Entellan

Alat

1. Gelas obyek dan gelas penutup
2. Pipet
3. Jarum Franke
4. Tissue
5. Bak pewarnaan

Cara Kerja

1. Siapkan gelas obyek yang bersih sesuai dengan jumlah yang diinginkan.
2. Ambil darah dari ujung jari tangan ke - 3, 4, atau 5 dengan menusuk menggunakan jarum Franke yang sebelumnya baik ujung jari maupun jarum sudah diusap terlebih dahulu dengan etanol 70 %.
3. Buang tetes darah pertama yang keluar dari ujung jari, dan pakailah tetes darah kedua, ketiga dan seterusnya.
4. Teteskan darah tersebut pada gelas obyek, kemudian dengan cepat dan hati-hati oleskan darah tersebut dengan memakai gelas obyek lain. Sudut pengolesan yang baik adalah 45o dan saat pengolesan cepat agar didapatkan olesan yang tipis.
5. Biarkan hasil olesan darah tersebut sampai kering di udara, kemudian fiksasilah dengan metanol selama 5 menit, dengan cara merendam gelas obyek yang sudah diolesi darah tadi ke dalam wadah (staining jar) yang telah berisi metanol.
6. Biarkan sediaan kering sekali lagi di udara, dengan jalan meletakkan gelas obyek pada posisi berdiri miring di bak pewarnaan. Setelah kering kembalikan pada posisi tidur dengan permukaan berisi olesan di permukaan atas.
7. Tetesi seluruh permukaan sediaan oles dengan larutan pewarna Giemsa 3 % dan biarkan selama 30 - 40 menit atau lebih lama lagi.
8. Cuci dengan akuades dingin
9. Biarkan lagi sediaan oles kering di udara.
10. Tetesi sediaan oles tadi dengan entellan, terutama pada bagian olesan darah yang diperkirakan sel-selnya tampak jelas, dan dengan segera setelah penetesan entellan, tutup bagian tadi dengan gelas penutup.
11. Periksa apakah pada saat penutupan tadi terdapat gelembung-gelembung udara, jika ada maka hilangkan dahulu gelembung-gelembung tadi dengan cara menekan gelas penutup dengan jarum.
12. Biarkan sampai kering, dan supaya rata dapat ditindih dengan menggunakan pemberat, dan beri label pada bagian gelas obyek yang kosong.

Read more »

Metode Mikroteknik

Metoda yang umum digunakan dalam mikroteknik adalah :

• Sediaan utuh
• Sediaan irisan
• Sediaan uraian
• Sediaan ulasan

Selain itu masih pula terdapat metoda lain seperti :

• Sediaan rentang
• Sediaan gosok
• Sediaan supravital

METODA SEDIAAN UTUH

Dengan metoda ini dipersiapkan sediaan yang terdiri atas keseluruhan organisme (baik hewan maupun tumbuhan) secara utuh, spesimen kultur, organ maupun bagian organ, embrio, sel telur, spermatozoa, potongan syaraf, pembuluh darah, jenis-jenis selaput tipis dan sebagainya. Melalui metoda ini diusahakan agar kita mendapat kesan bentuk asli dengan mempertahankan format-format tiga dimensi. Yang menjadi pembatas adalah faktor ukuran, ketebalan serta tingkat transparansi sediaan yang kita buat tersebut yang berkaitan dengan faktor pembesaran pengamatan melalui mikroskop nantinya. Sediaan dengan ketebalan 2 mm dan transparan akan memungkinkan untuk diamati sampai tingkat perbesaran tidak lebih dari 60 kali. Sediaan ketebalan 0,5 mm mungkin hanya akan mencapai tingkat perbesaran 100 kali.

METODA SEDIAAN IRISAN

Cara pengerjaan melalui irisan atau sayatan ini dianggap sebagai teknik rutin ataupun teknik baku bagi penyiapan spesimen histologi maupun histopatologi. Tebal tipisnya sayatan bergantung pada pengalaman serta tujuan penyiapan spesimen. Tebal sayatan yang umum berkisar 6 – 15 mikron ( 1 mikron = 0,001 mm ). 

METODA SEDIAAN URAIAN

Pengertian menguraikan adalah melakukan pemisahan-pemisahan komponen suatu jenis jaringan maupun organ tisu atau jaringan diuraikan dengan menggunakan jarum pengurai. Dengan demikian uraian disini diartikan sebagai pembedahan dalam skala kecil, tingkatannya berbeda antara pembelahan biasa dan pembelahan pengurai. Uraian ini dilakukan  pada jenis sediaan segar yang telah difiksasi tetapi belum memperoleh proses pewarnaan, maupun pada jenis sediaan yang telah difiksasi dan mengalami pewarnaan. Sebelum uraian biasanya dilakukan berbagai tindakan pendahuluan, misalnya dengan pelunakan tisu keseluruhan ataupun sebagian saja dengan jalan perendaman dalam air atau jenis larutan tertentu. Perlakuan pendahuluan yang umum dilakukan adalah adalah maserasi.

METODA SEDIAAN ULAS

Beberapa jenis tisu dapat disapukan rata pada kaca preparat untuk kemudian diamati baik setelah terlebih dahulu diberi maupun tanpa perwarnaan. Contoh terbaik pada metoda ulas ini adalah darah. Secara umum, jenis cairan yang berisikan sel-sel ataupun komponen-komponen tertentu. Melalui metoda sediaan ulas ini akan dapat ditelaah dengan bantuan mikroskop.

Secara umum jenis tisu yang biasa ditelaah melalui metoda ulas ini adalah ; darah, limfa, cairan sumsum tulang belakang, semen jantan, sediaan air seni serta beberapa lainya. Masing-masing biasanya memerlukan teknik perlakuan tersendiri dalam melakukan penglasan atau penyebarannya pada kaca preparat. Untuk jenis larutan yang menganung suspensi yang tinggi densitannya umumnya dicairkan dengan air ataupun serum darah dengan perbandingan 1 : 5 atau 1 : 10.

METODA SEDIAAN RENTANG

Pada metoda ini preparat sebelum difiksasi, diperlukan sedemikian rupa sehingga disamping lebih jelas juga mendekati keadaan aslinya dengan melalui perentangan. Jenis bahan siapan yang umum direntangkan pada saat difiksasi adalah otot, syaraf dan jenis jaringan tipis (selaput pembungkus jantung, hati, saluran pencernaan, dll).

METODA SEDIAAN GOSOK

Jenis jaringan yang keras sifatnya, seperti tulang, gigi, kuku dan beberapa lainnya mungkin sekali sangat sukar untuk dibuat sediaan sayatan. Untuk mengatasi hal diatas tadi, maka umum dibuat jenis sediaan dengan metoda gosok. Tulang, misalnya tulang paha, terlebih dahulu dipotong-potong hingga berukuran beberapa mili hingga 1 -2 cm. potongan atau serpihan tersebut kemudian digosok pada batu gosok atau jenis lainnya hingga cukup tipis untuk dapat diamati pada mikroskop, setelah terlebih dahulu diberi zat warna.

METODA SEDIAAN SUPRAVITAL

Selain jenis-jenis metoda yang memanfaatkan materi yang mengalami pematian dan fiksasi, kita dapat pula belajar banyak dari jaringan-jaringan selagi dalam keadaan hidup, baik yang berkaitan dengan pertumbuhan, perkembangan serta fungsinya. Sebagai contoh, kita dapat mengamati sirkulasi darah dalam membran yang tipis pada sayap kekelawar, pada mesenteri kodok, telinga mencit, tikus dan kelinci langsung dibawah mikroskop.

Untuk pengamatan sel-sel darah yang masih hidup, umumnya digunakan zat warna vital seperti yanus green ataupun neutral red, karena sel-sel darah mempunyai kemampuan untuk menghisap zat warna pada konsentrasi yang sesuai. Dengan zat-zat warna vital ini kita dapat mempelajari sel-sel secara baik, karena granula dan granulosit, demikian pula nucleus akan terwarnai dengan baik. Karena sitoplasmanya sendiri biasanya tidak akan mewarnai dengan jelas, maka hal ini memungkinkan kita untuk mempelajari perkembangan vakuola dalam sitoplasma misalnya.

Contoh penyiapan sediaan supervital darah adalah :

• 1 tetes darah diteteskan pada kaca preparat
• Teteskan pula 1 tetes zat warna (missal yanus green) dengan konsentrasi 0,25 dalam garam fisiologis
• Tutup dengan kaca penutup
• Biarkan selama 5 menit
• Beri lak petrolatum sekeliling tepi kaca penutup.

Salah satu metode yang sering digunakan dalam pembuatan preparat :

A.    Oles

1. Pembuatan film darah tipis
2. Pembuatan sediaan oles dari jaringan dengan menggunakan cara sederhana yaitu dengan menekan hati-hati potongan jaringan seperti otak, karena sel mudah lepas maka menggunakan objek dan kaca penutup.
3. Pembuatan film darah tebal yaitu untuk mengetahui parasit dalam darah.
4. Pembuatan film nanah tebal.
5. Metode oles untuk mengetahui siklus estrus pada mencit hingga manusia. Dengan menggunakan metilen blue = 0,1 %.
6. Sediaan oles untuk melihat kromosom dari leukosit medulla osseum (sumsum tulang). Dengan membuat larutan untuk menghambat aktifitas enzim pembentuk benang-benang spindle, metaphase terhenti sementara ± 24 jam.

Larutan :    

• Colchicine 0,5 % dalam buffer fosfat pH = 7
• Hipotonis = 1 bagian Buffer fosfat = 4 bagian Aquadetilatin
• Fiksatif carnoy = 1 bagian A. Aciticum glacial + 3 bagian methano

Langkah :

• Suntik burung dengan Colchicine 0,5 % intra muscular
• Diamkan selama 1,5 – 2 jam atau dibunuh
• Femus & tibiotarsus dibersihkan dari otot lalu dipotong
• Diletakkan, sumsum dikeluarkan, sisa sumsum dan lemak dibuang
• Suspensi ± 30 menit
• Centrifuge 400 rpm selama 5 menit
• Supennatan dibuang dan diganti dengan L. Carnoy 3 kali volume sumsum diamkan 5 menit
• Centrifuge seperti diatas larutan dibuang dan diganti dengan L carnoy diamkan 5 menit
• Campur dengan hati-hati
• Pipet suspensi tersebut, tetesi pada objek dan tutup
• Keringkan kemudian warnai menggunakan Giemsa / acetocarmine / Feulgen

Catatan :

• Mamalia, Aves = Colchicine dilarutkan dalam buffer pH = 7
• Ampibhia = Colchicine dilarutkan dalam ringer
• Larutan hipotonis untuk mamalia Natrium nitrat 1%

Read more »

Cara Mengambil Spesimen

Jenis jaringan normal

    Spesimen berasal dari hewan maupun tumbuhan besar biasanya dipotong dalam ukuran yang sesuai untuk dipakai pada sayatan selanjutnya. Hasil yang baik biasanya diperoleh dari blok-blok jaringan yang hanya berukuran beberapa millimeter saja. Untuk tujuan tertentu seringkali diperlukan spesimen berukuran dalam millimeter, namun spesimen berukuran kecil akan memberikan hasil yang lebih baik.
Pada waktu membedah dan memisahkan spesimen dari jaringan, organ maupun organisme, hendaknya dilakukan dengan hati-hati untuk menghindarkan terjadinya luka, kerusakan maupun sobekan. Pemotongan sebaiknya menggunakan pisau silet bermata satu. Jika skapel yang dipakai, gunakanlah skapel yang tajam. Bila menggunakan gunting untuk memotong, maka ditempat pemotongan biasanya terjadi kerusakan yang memerlukan  trimming (perautan) sedikit demi sedikit dengan silet. Teknik tertentu lainnya terkadang memerlukan pemecahan ataupun penggerusan yang biasanya tidak dilakukan pada persiapan blok-blok jaringan. Sebagian besar jaringan hewan umumnya lebih alot dan ulet serta lebih tahan terhadap perlakuan yang lebih kasar bila dibandingkan dengan jenis jaringan tumbuhan yang hidup. Jaringan tumbuhan biasanya bersifat agak rapuh, mudah belah maupun rusak.

Spesimen berasal dari hewan

Jaringan hewan dapat diambil dari makhluk tersebut selagi masih dalam keadaan hidup, setelah mengalami pembiusan maupun yang baru saja mati dan sesegera mungkin dimasukkan dalam larutan fiksatif. Organ-organ yang halus sifatnya seperti hati, jantung, buah pinggang maupun testis tikus atau kelinci dapat secara utuh langsung kedalam larutan fiksatif sebelum dipotong atau disayat dalam ukuran yang sesuai. Untuk usus, bila dikehendaki pemotongan dengan ukuran lebih dari satu sentimeter panjangnya, maka sebaliknya dilakukan peninjeksian larutan fiksatif ke dalam lumen usus tersebut agar lapisan mukosa di dalamnya dapat terfisasi dengan baik. Jenis otot maupun saraf sebaiknya direntangkan pada waktu fiksasi. Tulang vertebrata yang ukurannya kecil dapat difiksasi secara utuh, sedang untuk yang berukuran besar, agar dapat mengawetkan sumsum di dalamnya dengan baik, sebaiknya dilakukan  pemotongan baik melintang maupun membujur berukuran 5 – 10 mm terlebih dahulu. Cairan fiksatif mengandung formalin atau yang mengandung 10 – 15 % larutan formalin sudah cukup sesuai untuk memfiksasikan tulang maupun jenis jaringan yang memerlukan proses dekalsifikasi. Formalin mempunyai daya penetrasi yang baik dan melindungi bagian-bagian yang lembut terhadp daya kerja cairan pendekalsifikasi yang digunakan.
Jenis hewan tingkat rendah, seperti anabaena, paramecium, hydra, cacing ataupun jenis serangga umumnya memerlukan jenis perlakuan khusus. Banyak jenis hewan tersebut yang langsung dimasukkan kedalam cairan fiksatif yang sekaligus mematikannya, walaupun ada yang memerlukan pembiusan terlebih dahulu sebelum dijadikan  spesimen yang mendekati keadaan aslinya.
Bahan pembius yang umum digunakan adalah kloroform, eter, alkohol, methanol, kloreton, kokain, ataupun garam magnesium. Setelah pembiussan dapat dimasukkan dalam cairan fiksatif untuk proses selanjutnya.

Read more »